تاثیر انجماد دو مرحله‏ای، زمان اضافه کردن گلیسرول و ارتفاع پایوت ها از سطح ازت مایع بر کیفیت اسپرم قوچ پس از روند انجماد- ذوب

این تحقیق به منظور بررسی تاثیر زمان اضافه کردن گلیسرول، سرد سازی اولیه(انجماد دو مرحله ای) و ارتفاع پایوت ها از سطح ازت مایع بر کیفیت اسپرم قوچ پس از روند انجماد- ذوب انجام گرفت. برای این منظور نمونه منی از 4 راس قوچ قزل (سن 6 سال) جمع¬آوری و پس از ارزیابی اولیه از لحاظ حجم، غلظت، رنگ و حرکت توده ای مناسب با هم مخلوط شدند. نمونه مخلوط منی به دو قسمت مساوی تقسیم گردیدند. قسمت اول در دمای 37 درجه سانتی گراد با رقیق کننده حاوی 5 درصد گلیسرول رقیق شدند (روش یک مرحله ای). قسمت دوم ابتدا با رقیق کننده بدون گلیسرول رقیق شده و پس از کاهش دما به 4 درجه سانتی گراد و قبل از طی زمان تعادل، گلیسرول به میزان 5% به آن اضافه گردید (روش دومرحله ای). پس از طی زمان تعادل نمونه های رقیق شده در پایوت های cc5/0 پر شدند. برای ارزیابی تاثیر انجماد ( یا سردسازی) اولیه، پایوت ها به سه قسمت تقسیم شد. برای سرد سازی اولیه پایوت¬ها ابتدا در محفظه بالایی ظرف انجماد (دمای 25 -تا 35- درجه سانتی گراد) برای سه باز‏ه‏ی زمانی مختلف صفر، 5 و10 دقیقه قرار داده شدند. در مرحله نهایی انجماد هر گروه از پایوت¬ها به دو قسمت تقسیم شده و نیمی از آنها در ارتفاع 5/2 و نیمی دیگر در 5/3 سانتی متری ازت مایع به مدت 10 دقیقه برروی راک انجماد قرار گرفته و سپس در ازت مایع غوطه ور گردیدند. در نهایت از هر تیمار دو پایوت را ذوب و در داخل یک میکروتیوب با هم مخلوط نموده و برای مدت زمانی که آزمایش به طول می انجامید در داخل بن ماری 37 درجه قرار داده شد. برای ارزیابی تحرک از سیستم casa، درصد اسپرم ها زنده از رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین و برای سلامت غشای پلاسمایی اسپرم از host استفاده گردید. در صورت نیاز برای کاهش غلظت اسپرم ها و افزایش دقت casa، برای رقیق سازی بیشتر نمونه ها از همان رقیق کننده مربوطه استفاده می شد. اضافه کردن گلیسرول در دمای 37 و یا 5 درجه سانتی گراد تاثیر معنی داری برروی هیچکدام از پارامترهای اسپرم نداشت (p?0.05). در اسپرم های منجمد شده در ارتفاع cc5/2 از ازت مایع درصد اسپرم های دارای حرکت پیشرونده، درصد اسپرم های زنده و درصد اسپرم های دارای غشای پلاسمایی سالم بیشتر از اسپرم هایی بود که در ارتفاع cm5/3 منجمد شده بودند (p<0.05). در نمونه¬هایی که به روش یک مرحله¬ای رقیق شده بودند درصد کل تحرک، درصد اسپرم های دارای حرکت پیشرونده، درصد اسپرم هایی زنده و درصد اسپرم های با غشای پلاسمایی سالم بیشتر از نمونه های بود که بدون سردسازی اولیه منجمد شده بودند در صورتیکه در روش دو مرحله ای اثر معنی داری مشاهده نگردید. به طور کلی بر اساس نتایج به دست امده از این تحقیق، انجماد منی قوچ در ارتفاع cm5/2 سانتی متر از ازت مایع باعث حفظ بیشتر کیفیت اسپرم ها شده و سردسازی اولیه در دمای 20- تا -30 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه در نمونه هایی که به روش یک مرحله ای رقیق شده بودند باعث بهبود کیفیت اسپرم ها می گردد. همچنین اضافه گردن گلیسرول در دمای 37 یا 5 درجه سانتی گراد تاثیری برروری کیفیت اسپرم ها پس اتز انجماد ندارد.